培养细胞转染效率的测定

转染是什么?

转染是将核酸引入动物细胞，使细胞引入特定基因表达感兴趣的蛋白质的过程。通过转染引入的核酸称为外源核酸。基因可以在没有病毒的情况下被引入目标细胞，这与需要病毒转移DNA的转导不同。
可以暂时引入核酸以表达蛋白质，或与宿主细胞的基因组一起表达蛋白质。临时引入核酸被称为瞬时转染，并用同时核酸复制转染被称为稳定的转染。因此，转染可用于增强或抑制转染细胞中的特异性基因表达，或产生重组蛋白质。

转染原则

细胞膜由包含蛋白质的脂质双分子层组成，带有负电荷，阻止带负电荷的大的核酸，如DNA和RNA通过。要使转染成为可能，核酸必须以其他方式通过细胞膜。让核酸通过细胞膜的其他方法包括化学方法、生物方法和物理方法，每种方法都有不同的原理。本节以将基因导入细胞为例解释每种方法。

提高转染效率

转染效率是靶细胞摄取核酸的效率。本节介绍了提高转染效率需要考虑的各种因素。

细胞活力和传代

转染前细胞活力应至少为90%。传代——将细胞从培养液转移到新的培养基中，也应在转染后24小时内进行。此外，需要注意的是，过多的传代会对转染效率产生不利影响，因此应该仔细注意传代数量。

细胞培养物和试剂

con流畅性是指细胞理想的转染增殖状态，因检测目的、方法、细胞类型等不同而有所不同。如果合流过高，可能导致核酸摄取不足或转基因表达减少。如果合流过低，细胞间可能不会发生接触，从而阻止细胞增殖。
用于转染的生长细胞的最佳培养基取决于细胞，试剂和细胞型血清。当DNA引入干细胞时，例如，能够将核酸引入胚胎干细胞（ES细胞）中的试剂，诱导多能干细胞（IPS细胞），人成人干细胞和具有高效率和低毒性的其他类型的细胞使用。当将RNA引入干细胞时，使用能够引入si​​RNA（小干扰RNA），mRNA（信使RNA）和DSRNA（双链RNA）的试剂，同时保护干细胞免于降解。

转染方法选择

转染方法包括化学、生物和物理转染。培养细胞的靶向转染通常采用化学转染和物理转染。生物转染对培养细胞和动物细胞转染都是有效的。然而，根据细胞类型和条件的不同，化学转染会导致转染效率或化学毒性的变化，并且对某些细胞进行选择性转染是困难的。同时，物理转染需要特殊的仪器设备，核酸容易受损。生物转染也有污染的风险，在将治疗基因引入细胞染色体时插入突变，以及基于免疫的失活。
由于每种方法都有各自的缺点，因此必须针对转染细胞与靶细胞的特定组合，选择一种转染效率高、重现性高的转染方法。

其他因素

转染效率也取决于是否使用血清或抗生素。例如，当引入DNA时，在含有血清的培养基中培养细胞可以提高效率。在含抗生素的培养基中进行瞬时转染也能提高转染效率。
然而，抗生素也可以引起细胞毒性，这可能会对细胞产生不利影响并降低转染效率。此外，DNA和RNA载体均可用于瞬时转染，但只能使用DNA载体用于稳定转染。

检测转染效率

用于测量转染效率的一般方法是使用荧光显微镜。通过计数观察到的细胞的总数和表达荧光的细胞数量来测量转染效率，并评分这些值。

转染效率测量的挑战

传统的荧光显微镜存在着各种各样的问题，而且经常难以使用。
首先，观察荧光需要将标本带到暗室进行实验，操作性极差。准确提取细胞的轮廓也很困难，阻碍了对细胞数量的精确计数。
此外，为了计算和分析细胞数量，需要分离于荧光显微镜系统的软件，这导致许多客户注意到进行平滑分析的困难。

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